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牛津杯法抑菌試驗流程OD600含義與實驗儀器設備推薦

作者:三利  轉載自:  發布日期:2020/4/2

牛津杯法抑菌試驗流程OD600含義與實驗儀器推薦

1. 原理

將加有牛津杯的雙層平板置于培養箱中培養,一方面試驗菌(病原菌)開始生長繁殖,另一方面抑菌物質呈球面擴散,形成遞減的梯度濃度。牛津杯周圍抑菌濃度范圍內的細菌生長被抑制,形成透明的抑菌圈,抑菌圈的大小反映抑菌物質對指示菌的抑制程度。


2.  儀器、設備[推薦]

2.1 超凈工作臺

2.2恒溫培養箱36±1

2.3恒溫水浴鍋:50±1

2.4高壓滅菌鍋。

2.5平皿:直徑為9 cm

2.6 移液器20~200μL100~1000μL1~5mL)及配套無菌槍頭。

2.7試管:15×150 mm

2.8 酒精燈。

2.9試管架。

2.10渦旋混勻器。

2.11搖床36±1

2.12牛津杯。

2.13光度計


3. 病原菌、培養基及其他

3.1病原菌:大腸桿菌:ATCC25922、沙門氏菌: ATCC14028、金黃色葡萄糖球菌:ATCC6538

3.2 抑菌物質:益生菌(乳酸菌、芽孢菌)、抗生素或其它抑菌物質。

3.3 培養基

1)大腸埃希菌:營養肉湯、營養瓊脂半固體(瓊脂粉含量:1%)、營養瓊脂(瓊脂粉含量:2%)。

2)金黃色葡萄球菌:營養肉湯、營養瓊脂半固體(瓊脂粉含量:1%)、營養瓊脂(瓊脂粉含量:2%)。

3)沙門氏菌:營養肉湯、營養瓊脂半固體(瓊脂粉含量:1%)、營養瓊脂(瓊脂粉含量:2%)。

4)乳酸菌:MRS肉湯。

5)芽孢菌:營養肉湯。

3.4 其它:

0.85%滅菌生理鹽水,滅菌蒸餾水

4 測定流程

4.1病原菌擴培:

在超凈工作臺內,挑取新鮮的斜面保藏病原菌1環,接種于100mL無菌的營養肉湯培養基中,接種完畢,將三角瓶置于搖床內固定,37200rpm,培養16-20h。將培養好的病原菌菌懸液用空白營養肉湯培養基稀釋10倍,若OD6000.30-0.36之間, 則為有效病原菌菌懸液,此時病原菌菌懸液原液中病原菌含量約為109cfu /ml

4.2 抑菌物質(抗生素或益生菌菌懸液)的制備:

1)抗生素:抗生素或其它藥物用無菌水稀釋至所需要的濃度。

2)乳酸菌擴培:

無菌條件下稱取相當于約10CFU量的乳酸菌菌粉(如果是包衣產品需要在稱樣前無菌條件下研磨釋放乳酸菌),接種于100mLMRS液體培養基中,37靜置培養24~48h即為擴培好的乳酸菌菌懸液。

3)芽孢菌擴培:無菌條件下稱取相當于約10CFU量的芽孢菌菌粉,接種于100mL 營養肉湯培養基中,接種完畢,將三角瓶置于搖床內固定,37200rpm,培養14~18小時即為擴培好的芽孢菌菌懸液。

4.3雙層平皿的制備:

取平皿分別傾注營養瓊脂培養基15-18mL,使其在平板內均勻攤布,放置水平臺面上使凝固,作為底層,將平皿倒置平均劃分區域并標記添加物。另取半固體營養瓊脂培養基適量放冷至4850 ,將4.1中病原菌菌懸液原液稀釋至106cfu /mL左右,每4.5mL半固體營養瓊脂培養基加入0.5mL,倒入每平皿中,使其在底層上均勻攤布,作為菌層。放置在水平臺上冷卻后,在每1平皿中以劃分好的區域等距離均勻安置牛津杯4個備用。

4.4 抑菌試驗:

4.2步驟中準備的抑菌物質,每個雙層平皿中的牛津杯中分別滴裝200μL37靜置培養16-20h后,測量各抑菌圈直徑(或面積)以作出評價。選取典型平皿拍照片。

備注:牛津杯的放置一定要平穩、到位,確保底部準確插到兩層平皿之間;抑菌物質添加時確保全部加到牛津杯內部,不要灑在牛津杯外壁或外部,如果灑在外面會形成乳酸菌或芽孢菌在抑菌圈的生長;如果無法控制乳酸菌或芽孢菌在牛津杯外面的生長,可以將乳酸菌、芽孢菌菌懸液在無菌離心管中離心,取其上清加入牛津杯中做抑菌試驗。

4.5 抑菌性能評價

抑菌性:

抑菌圈<10mm為無抑菌作用,抑菌圈>10mm15mm 的為中度抑菌,抑菌圈>15mm的為高度抑菌。

備注:抑菌圈越大說明抑菌效果越好;抑菌圈是指圓形透明圈的整個直徑;牛津杯外徑為8mm

 

牛津杯(Oxford Cup)法是抗生素效價測定的一種方法,通常可以分為二劑量法和三劑量法。

牛津杯(Oxford Cup)法是抗生素效價測定的一種方法,通常可以分為二劑量法和三劑量法。

操作方法:將已滅菌的瓊脂培養基加熱到完全融化,倒在培養皿內,每皿15ml(下層),待其凝固。此外,將融化的PDA培養基冷卻到50℃左右混入試驗菌,將混有菌的培養基5 ml加到已凝固的培養基上待凝固(上層)。

以無菌操作在培養基表面直接垂直放上牛津杯(內徑6mm、外徑8mm、G*10 mm的圓形小管,管的兩端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),輕輕加壓,使其與培養基接觸無空隙,在杯中加入待檢樣品(發酵液),牛津杯一般可以裝240微升,勿使其外溢。加滿后置37℃培養16-18小時,觀察結果,抑菌圈用尺直接量就可以。在培養中,一方面試驗菌開始生長,另一方面抗生素呈球面擴散,離杯越近,抗生素濃度越大,離杯越遠抗生素濃度越小。隨著抗生素濃度減小,有一條最低抑菌濃度帶,在帶范圍內,菌不能生長,而呈透明的圓圈,這就叫“抑菌圈”。抗生素濃度越高,抑菌圈越大。

OD600指的是某種溶液在600nm波長處的吸光值吸光值正比于溶液中的吸光物質的濃度;實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液,之后定量培養后的含菌培養液。

ODoptical density(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度,是檢測方法里的專有名詞,檢測單位用OD值表示,1OD=log10(1/trans),其中trans為檢測物的透光率T值。光通過被檢測物,前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。

OD600的一個重要應用,就是利用細菌的吸光來測量細菌培養液的濃度,從而估計細菌的生長情況,所以通常用來指菌體細胞密度。 如,測量細菌培養液在600nm處的吸光值,得到的OD600的數值如果在0.6-0.8之間,表明細菌處于旺盛生長的對數生長期,OD600>3表明細菌已經飽和等。細菌的生長情況,可以通過測OD600來監測。細菌的生長比較好的時期是在OD6001,此時可以進行轉代等研究.在細菌的培養中,OD600超過0.8就要稀釋培養液。【說明:資料擇自網絡】

 



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